Ejemplo de Terapia Génica en Diabetes Mellitus tipo 2

La terapia génica es un tratamiento médico que consiste en manipular la información genética de células enfermas para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva función que les permita superar una alteración. Estudios que se están realizando pueden clasificarse en 4 grupos:

• Promover la regeneración de las células beta o precursores de éstas.
• Modular la respuesta metabólica de la glucosa y secreción de insulina.
• Modificar la resistencia a la insulina que se genera en la diabetes tipo 2.
• Proteger las células beta y evitar la respuesta autoinmune que destruye de forma irreversible éstas células originando diabetes tipo 1.

Actualmente, se están estudiando los genes implicados en la morfogénesis de las células endocrinas inmaduras como el PDX-1, un importante transactivador del gen de la insulina y que, además, también está implicado en la transactivación de otros genes como el gen del transportador de la glucosa GLUT2 y la enzima glucocinasa, implicados en la ruta que integra la señal de glucosa en el exterior de la célula con la consecuente secreción de insulina.

Otra alternativa para el tratamiento de la diabetes tipo 2 es la modificación de células betapancreáticas.

Generación de células no beta productoras de insulina

Como consecuencia de la dificultad para obtener células beta pancreáticas, grupos de investigadores han iniciado diferentes trabajos para generar células no beta que secreten insulina en respuesta a los valores de glucosa.
Los investigadores cuentan con una línea celular que se obtuvo a partir de células neuroendocrinas, conocida como AtT20 y que tiene la particularidad de segregar lo que en su interior se sintetiza.
En esta línea celular se le ha introducido el gen de la proinsulina humana y, al ser estimulada por mediadores como el AMPc y el Ca+2 a través de un mecanismo muy similar al utilizado fisiológicamente, es capaz de segregar insulina, pero las concentraciones plasmáticas no son las deseadas. 

Bibliografia:
Sandra Torrales, Terapia génica para curar la diabetes, VOL 22 NÚM 4 ABRIL 2003, http://www.elsevier.es/es-revista-offarm-4-articulo-terapia-genica-curar-diabetes-13046057. accessed (20/12/2015).
http://www.elsevier.es/es-revista-offarm-4-articulo-terapia-genica-curar-diabetes-13046057

EJEMPLO DE TERAPIA DE STEM CELLS EN DIABETES MELLITUS

En la actualidad existen terapias para los 2 tipos de diabetes que resultan insatisfactorias porque no ofrecen una cura de la enfermedad, y en la mayoría de los casos no podrán evitar la aparición de las complicaciones secundarias asociadas a ella.

Una de ellas es el transplante de islotes pancreáticos que ha sido sin duda una esperanzadora estrategia para restaurar la masa de célula funcional en los pacientes diabéticos y poder así conseguir la normoglicemia; no obstante, presentan limitaciones, como el rechazo del injerto y el número de páncreas necesarios para la obtención de una cantidad óptima de islotes (al menos 2 donantes/pacientes).

Esto demuestra la necesidad de identificar nuevas terapias genéticas como, por ejemplo, la obtención de células productoras de insulina a partir de células pluripotentes. Básicamente han sido utilizadas 2 estrategias de selección para células con capacidad de diferenciación beta celular, que son las siguientes:

Estrategia de Trapping: Las stem cells son transfectadas con una construcción que lleva un gen de resistencia a un antibiótico (neomicina) el cual está bajo el control del gen de la insulina. De esta manera, se seleccionan las células que al diferenciarse activarán únicamente dicho promotor; posteriormente, se añade a la construcción un marcador no tóxico, pero fácilmente perceptible: la proteína fluorescente del verde (GFP), de manera que las células expresan insulina y proteína verde, lo que permite una selección más fina de estas.

De ese modo, se estableció la línea celular IB/3x-99 derivada directamente de un cultivo de células ES de ratón, las cuales tienen la capacidad de formar los agregados de las células que secretaron la insulina de una manera dependiente de la glucosa.

Los agregados celulares fueron implantados en el bazo de ratones. La mayoría de los animales presentaron un control de la glucosa de la sangre.

Marcadores selectivos de células madre pancreáticas: La nestina es una proteína del filamento que se ha identificado por ser un marcador de células stem del sistema nervioso central. Por existir muchas similitudes entre ellas y las del páncreas, Lumelsky propuso a la nestina como un marcador específico de célula stem endocrina.

Referencias bibliográficas:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-29532004000200007

EJEMPLO DE TRANGÉNICO PARA DIABETES MELLITUS

Insulina humana transgénica (Humulin)

Antes de la aparición de la insulina humana actual, a los diabéticos se les administraba insulina de cerdos y vacas, estas insulinas eran muy parecidas a la humana aunque algunos de sus componentes (los aminoácidos) eran ligeramente diferentes y esto llevaba a la producción de una reacción inmune en contra de la insulina terminaba siendo ineficaz.

La producción de insulina humana se consiguió gracias a la ingeniería genética o metodología del ADN recombinante. Mediante esta metodología es posible obtener enormes cantidades de una proteína (insulina), aislada de todos los componentes celulares del organismo de origen.

Pasos

•   Se aisló y se cortó el gen productor de la insulina humana del resto de ADN humano.
• Se insertó dicho gen en la bacteria E. coli.
• Se potenció la multiplicación de las E. coli transgénicas que producían insulina en cultivos bacterianos para obtener un gran número.
• De esta población se extrae la insulina producida.  

 Ventajas y Desventajas de los transgénicos

Ventajas de los transgénicos

• Crear alimentos en laboratorios puede ser, a largo plazo, una buena solución para acabar con la escasez de comida y el gasto de recursos valiosos.

• La alteración genética y los avances de los transgénicos son, ante todo, una muestra importante de que la ciencia en poco tiempo podría resolver muchos problemas desde su más complicado origen, incluso en las personas.

• Por el lado económico, pronto podrían convertirse en una alternativa para ayudar a los países en crisis, donde las personas batallan para comprar o conseguir alimentos básicos.

• Se ha demostrado que los organismos transgénicos son muy útiles en el análisis de la función de productos genéticos específicos.

• El gen ajeno se expresa en todas las células de los organismos, por lo tanto, es posible observar el efecto producido en el desarrollo y estudiar su función concreta.

Desventajas de los transgénicos

• Estos alimentos pueden derivar en consecuencias secundarias para la salud de las personas y además negativas.

• No son tan nutritivos como la comida orgánica, que al ser cultivada de la manera tradicional, tiene la oportunidad de asimilar todos los nutrientes que el organismo necesita para estar saludables.

• Muchas organizaciones proambientales han denunciado el uso de ratas de laboratorio, para probar los transgénicos generados en laboratorios.

• Existe también la probabilidad de incluir pesticidas, químicos y otras sustancias que si bien no podrían ser un peligro directo para salud, si tienen la posibilidad de derivar en uno.

• Se han desarrollado plantas con capacidades insecticidas que pueden amenazar la existencia de especies de insectos y hongos beneficiosos e incluso imprescindibles para el desarrollo biológico.

 Referencias bibliográficas:

http://ecologiteca.com/ventajas-y-desventajas-de-los-alimentos-transgenicos/ 

http://www.agroparlamento.com/agroparlamento/notas.asp?n=0802 

http://naukas.com/2012/01/05/exitos-transgenicos-la-insulina/ 

 

ADN recombinante en Diabetes Mellitus

La ingeniería genética ha permitido tratar a los pacientes con diabetes, mediante la utilización de ADN recombinante, este mecanismo permite que la insulina humana pueda producirse en otros organismos y así poder utilizarla para el tratamiento de pacientes. Como ejemplos tenemos:

• Glusilina: se obtiene por tecnología de ADN recombinante, en escherichia coli. Tratamiento de pacientes adultos con diabetes mellitus.

• Insulina lispro: origen ADN recombinante producida en E. coli para el tratamiento de adultos y niños con diabetes mellitus que requieran insulina para el mantenimiento de la hemostasia normal de la glucosa. Humalog también está indicado en la estabilización inicial de diabetes mellitus.

• Insulina Aspart: producida por ADN recombinante en Saccharomyces cerevisae, tratamiento de pacientes con diabetes mellitus.

Referencias bibliográficas:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1561-29532006000300005&script=sci_arttext

Ejemplo de ADN recombinante en la naturaleza

La recombinación genética es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de DNA de dos orígenes diferentes. La recombinación de eucariotas comúnmente se produce durante la meiosis como entrecruzamiento cromosómico entre los cromosomas apareados. Enzimas llamadas recombinasas catalizan las reacciones de recombinación natural. RecA, en la Escherichia coli que es responsable de la reparación de las roturas en el ADN de doble hebra. En levaduras y otros microorganismos se requieren 2 recombinasas: Proteína RAD51 para recombinación mitótica y meiótica y la proteína DMC 1 de la recombinación meiótica. 

Tipos de recombinación genética en eucariotas :

· Recombinación homóloga (profase I meiosis)
· Entrecruzamiento cromosómico (anafase I meiosis)
· Cambio de clase de inmunoglobulinas (IgM – IgG)
· Recombinación específica de sitio (virus – bacteriófago T4 y plásmidos)
· Recombinación no homologa ( células de mamíferos)

Referencias bibliográficas:

https://es.scribd.com/doc/70708591/Recombinacion-genetica
http://www.ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html

Análisis de PCR en Diabetes Mellitus

Tema: Estudio génico (OPG, RANKL, Runx2 y receptores AGE) en cultivos de osteoblastos humanos de pacientes con diabetes mellitus tipo 2 y fractura de cadera. Influencia de los niveles de glucosa y AGEs.

Objetivo:Valorar si las variaciones de glucosa circulante generan alteraciones en la expresión de genes relacionados con la diferenciación y actividad osteoblástica (OPG, RANKL, Runx2 y AGER) en el cultivo primario de osteoblastos (hOB).

Muestra: Cultivos primarios de osteoblastos humanos (hOB) a partir de hueso trabecular.

Tipo de ácido nucleico: ARNm genómico

Extracción de ADN

Lisis: Kit High Pure RNA Isolation

Separación: Kit High Pure RNA Isolation

Purificación:  Kit High Pure RNA Isolation

Gen a amplificar: OPG, RANKL, Runx2 y AGER

Tipo de PCR: PCR en tiempo real

Pasos

• Desnaturalización
• Hibridación
• Elongación

Visualización: EFO

Bibliografía :

 http://www.revistadeosteoporosisymetabolismomineral.com/pdf/articulos/12012040100070014.pdf

Pruebas de tamizaje y confirmatorias para diabetes

Pruebas de tamizaje:

• Glucemia en ayunas
• Medición de la glucemia 2 horas post carga de glucosa

La glucemia en ayunas es la prueba más sencilla para el tamizaje oportunístico de Diabetes Mellitus en personas asintomáticas que por algún motivo acuden a un servicio de salud. Sin embargo, la prueba de oro para el tamizaje de diabetes en estudios poblacionales sigue siendo la medición de la glucemia 2 horas post carga de glucosa . Es muy importante tener en cuenta que una prueba de tamizaje solo indica una alta probabilidad de tener DM y debe ser confirmada con una prueba diagnóstica. Actualmente se han desarrollado algunos cuestionarios sencillos cuyo puntaje permite establecer la probabilidad de tener diabetes y se pueden utilizar como pruebas de tamizaje siempre y cuando se hallan validado localmente.

Diagnostico Diabetes Mellitus

	Glucemia en ayunas		Glucemia en PTOG
	mg/dl	mmol/L	mg/dl	mmol/L
Plasma o suero venoso	> 126	> 7	> 200	> 11.1
Sangre total venosa	> 110	> 6.1	> 180	> 10
Plasma capilar	> 126	> 7	> 220	> 12.2
Sangre total capilar	> 110	>6.1	>200	> 11.1

Pruebas confirmatorias:

• Determinación de glucosa en sangre
• Diagnostico de hemoglobina glicosilada (Hba1c)
• Determinacion de anticuerpo por metodo de ELISA

Los síntomas como poliuria, polidipsia, polifagia, astenia o cetoacidosis conllevan a la sospecha clínica de la diabetes.
Sin embargo, el diagnóstico de diabetes se confirma mediante determinación de glucosa en sangre, que se realizan ante situaciones de sospecha clínica o bien en estudios de detección sistemática (diagnóstico de diabetes gestacional y estudios epidemiológicos); otro método confirmatorio para la diabetes es el diagnóstico la hemoglobina glicosilada (Hba1c), la cual es una heteroproteína de la sangre que resulta de la unión de la Hb con carbohidratos libres.

Bibliografía: 

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/patientinstructions/000082.htm   

http://apuntesmedicos.net/2008/05/27/diagnostico-de-la-diabetes-mellitus-y-otros-problemas-metabolicos-asociados-a-regulacion-alterada-de-la-glucosa/

http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0864-21252006000100012&script=sci_arttext